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Sep 30, 2023

Helixförmige Polyprolin-Frostschutzproteine ​​vom Typ II sind in Collembola weit verbreitet und entstanden wahrscheinlich vor über 400 Millionen Jahren im Ordovizium

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 8880 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Frostschutzproteine ​​(AFPs) binden sich an Eiskristalle, um das Einfrieren von Organismen zu verhindern. Bei Fischen und Insekten wurde eine Vielzahl von AFP-Falten gefunden, darunter Alpha-Helices, globuläre Proteine ​​und verschiedene Beta-Solenoide. Die Vielfalt der AFPs bei flugunfähigen Arthropoden wie Collembola wurde jedoch noch nicht ausreichend untersucht. Hier wurde gezeigt, dass bei 18 der 22 Collembola-Arten aus kalten oder gemäßigten Zonen eine Frostschutzaktivität vorhanden ist. Zur Charakterisierung dieser AFPs wurden mehrere Methoden verwendet, darunter Isolierung durch Eisaffinitätsreinigung, MALDI-Massenspektrometrie, Analyse der Aminosäurezusammensetzung, Tandem-Massenspektrometrie-Sequenzierung, Transkriptomsequenzierung und bioinformatische Untersuchungen von Sequenzdatenbanken. Alle diese AFPs hatten einen hohen Glycingehalt und es wurde vorhergesagt, dass sie die gleiche helikale Bündelfaltung von Polyprolin Typ II aufweisen, eine Falte, die nur bei Collembola vorkommt. Diese Hexapoden entstanden im Ordovizium, wobei die beiden Ordnungen, von denen bekannt ist, dass sie AFPs produzieren, vor etwa 400 Millionen Jahren während der Anden-Sahara-Eiszeit auseinander gingen. Daher ist es wahrscheinlich, dass die AFP damals entstand und in vielen Abstammungslinien während der folgenden zwei Eiszeiten und dazwischenliegenden Warmperioden bestehen blieb, im Gegensatz zu den AFPs von Fischen, die unabhängig voneinander während der känozoischen Eiszeit vor etwa 30 Millionen Jahren entstanden.

Organismen, die in Umgebungen mit Minustemperaturen leben, müssen sich anpassen, um Zellschäden durch Gefrieren zu vermeiden. Die Bildung von Eiskristallen in lebenden Geweben birgt die Gefahr der Austrocknung der Zellen und des Bruchs der Zellmembranen, was zum Tod führen kann1. Organismen, die Nischen bewohnen, in denen Temperaturen unter Null herrschen, produzieren häufig Frostschutzproteine ​​(AFPs), deren Funktion darin besteht, an Eiskristallen zu haften und deren Wachstum zu verhindern2. Sobald es gebunden ist, beschränkt sich das Eiswachstum auf Bereiche rund um das AFP, wodurch sich Mikrokrümmungen auf der Eisoberfläche bilden3,4. Dadurch ist es für Wasser energetisch ungünstig, sich dem Eisgitter anzuschließen, was zu einem Absinken der Gefriertemperatur unter die Schmelztemperatur führt, was als thermische Hysterese (TH) bezeichnet wird und zur Quantifizierung der Wirksamkeit eines AFP verwendet wird.

Das erste charakterisierte AFP stammte von einem Knochenfisch5. Seitdem wurden AFPs bei anderen Fischen6, Insekten7,8 und Mikroorganismen9,10,11 beobachtet. Es wird angenommen, dass AFPs bei Fischen während des Känozoikums entstanden sind, das vor 20 bis 40 Millionen Jahren begann, als zum ersten Mal seit etwa 200 Millionen Jahren Meereis an den Polen vorhanden war12,13. Im Meerwasser senkt die hohe Konzentration von NaCl (~ 0,45 M) die Gefriertemperatur des Meerwassers auf ~ − 1,9 °C. Da Fischblut eine geringere Konzentration an gelösten Stoffen aufweist und bei ~ − 0,8 °C gefriert, könnte jeder Kontakt mit Eiskristallen zum Gefrieren führen und den Fisch töten5. Folglich müssen Fisch-AFPs in ausreichenden Mengen und mit ausreichender Aktivität produziert werden, um die Gefriertemperatur des Körpers um mindestens 1,1 °C zu senken. Dies verschafft diesen Fischen einen Selektionsvorteil, da sie in eisbedeckten Meeren, in denen Fische ohne AFPs Gefahr laufen, einzufrieren, sicher nach Nahrung suchen können. Es wurden vier Arten von AFPs in Fischen gefunden: (1) Alanin-reiches Typ-I-AFP, (2) lektinähnliches Typ-II-AFP, (3) Typ-III-AFP, abgeleitet von Sialinsäuresynthase, und (4) Frostschutz-Glykoproteine ​​( AFGPs). Bei unterschiedlichen Falten, die alle die gleiche Funktion erfüllen, stellt sich die Frage, wie diese AFPs ursprünglich entstanden sind14.

Alaninreiche alpha-helikale Typ-I-AFPs haben sich unabhängig voneinander bei mindestens vier Gelegenheiten entwickelt15. Die einfachen repetitiven AFGPs sind bei zwei unabhängigen Gelegenheiten entstanden, einmal aus einem Trypsinogen-Gen durch Duplikation und Divergenz16. Typ-II-AFPs haben sich aus einem C-Typ-Lectin-Vorläufer entwickelt und wurden durch lateralen Gentransfer auf mindestens zwei entfernte taxonomische Zweige von Fischen verbreitet17,18. Die Duplikation und Divergenz eines Sialinsäure-Synthase-Gens hat zur Entstehung der Typ-III-AFP-Genfamilie geführt, die nur in einem Fischzweig gefunden wurde19. Es wird angenommen, dass diese AFP-Falten der Fische innerhalb der letzten paar Dutzend Millionen Jahre als Reaktion auf die Polarvereisung entstanden sind20. In anderen Zweigen von Organismen wie Insekten21,22 und Mikroorganismen23,24 gibt es auch Beispiele, in denen verschiedene AFP-Falten unabhängig voneinander entstanden sind, um dieselbe Aufgabe zu erfüllen.

Collembola sind die am häufigsten vorkommenden terrestrischen Arthropoden und kommen auf allen Kontinenten vor25. Diese kleinen Organismen (meistens sind sie nur wenige Millimeter lang) leben normalerweise im Boden, einige Arten leben jedoch auch in Bäumen, auf Teichen oder feuchten Oberflächen rund um Steine ​​oder auf Gletschern. Collembola erhielten ihren Namen von einem Bauchorgan, dem Kollophor, das an der Osmo- und Ionenregulation26 beteiligt ist. Ein zweites charakteristisches anatomisches Merkmal des Abdomens ist ein federbelastetes Organ namens Furca, das es ihnen ermöglicht, Raubtieren durch „Springen“ zu entkommen. Dies hat ihnen den Spitznamen „Springschwänze“ eingebracht. Diese primitiven Organismen entstanden vor etwa 450 Millionen Jahren und es gibt bis heute fast 10.000 klassifizierte Arten27. Diejenigen, die in Umgebungen mit Minusgraden leben, verfügen über Kältetoleranzmechanismen, um unter diesen rauen Bedingungen zu überleben, darunter die Produktion von AFPs. Zuvor wurde festgestellt, dass einige Collembola-Arten TH-Aktivität28,29,30,31 sowie Kältehärte und Unterkühlungsfähigkeiten32 aufweisen, aber bisher wurde keine systematische Untersuchung der vorhandenen AFP-Typen und ihrer Verbreitung in Collembola durchgeführt.

Das erste charakterisierte Collembolan-AFP war die kleine 6,5-kDa-Isoform aus Hypogastrura harveyi (HhAFP)29. Es wurde vorhergesagt, dass HhAFP eine helikale Bündelfalte aus glycinreichem Polyprolin Typ II (PPII) aufweist33, eine Struktur, die später durch Röntgenkristallographie bestätigt wurde34,35. Diese Falte, die nur bei Collembola vorkommt, besteht aus zwei Schichten antiparalleler PPII-Helices, die durch Schleifenregionen verbunden sind. Jede Drehung um die Helix ist genau drei Reste lang mit Tripeptidwiederholungen von G-X1-X2, wobei X1 häufig Glycin ist. Der Kern des Proteins enthält die nach innen gerichteten Glycinreste, was aufgrund des Fehlens von Seitenketten eine dichte Packung ermöglicht33. Die kompakte Packung der Helices ermöglicht die Entwicklung eines Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerks zwischen den Helixgerüsten, das die Stabilität der Falte erhöht36. Die beiden Schichten haben beide eine nach außen gerichtete Seite. Eine Oberfläche ist flach, enthält kleine, hydrophobe Rückstände und fungiert vermutlich als eisbindende Oberfläche (IBS)37. Diese Oberfläche ist reich an Alanin, enthält aber auch Serin-, Threonin- und Valinreste. Die gegenüberliegende Oberfläche ist uneben und enthält größere Rückstände, von denen einige polar oder geladen sind. H. harveyi produziert auch eine größere 15,6-kDa-AFP-Isoform, die vermutlich 13 Polyprolin-Helices aufweist38.

Ein mutmaßliches Homolog von HhAFP wurde kürzlich aus Megaphorura arctica (MaAFP) charakterisiert, das in Island gesammelt wurde31. Obwohl das 6,5-kDa-MaAFP große Ähnlichkeiten in der Kodierungssequenz mit HhAFP aufweist, weichen ihre untranslatierten Regionen (UTRs) so stark voneinander ab, dass eine gemeinsame Abstammung nicht definitiv festgestellt werden konnte. Zusätzlich wurden 9,6-kDa-AFP-Isoformen aus Granisotoma rainieri (GrAFP) untersucht39. Die Struktur von GrAFP wurde als Polyprolin-Typ-II-Bündel mit neun Helices modelliert, was mittels Röntgenkristallographie bestätigt wurde. Beim Vergleich der UTRs der fünf GrAFP-cDNAs zeigten die unterschiedlichsten nur eine Sequenzidentität von 69 %. Daher widerlegt ein Mangel an Ähnlichkeit zwischen den UTRs verschiedener Arten die Homologie nicht.

Hier haben wir die AFPs von 18 Collembola-Arten aus zahlreichen Familien innerhalb von zwei der vier vorhandenen Collembola-Ordnungen charakterisiert, die auf vier verschiedenen Kontinenten gesammelt wurden. Der Umfang der Analyse wurde durch die Menge der verfügbaren Biomasse bestimmt. Zur Bestimmung der TH-Aktivität und Eisformung wurden kleine Mengen Springschwänze (< 100 mg gefriergetrocknetes Gewebe) verwendet. AFPs wurden aus größeren Proben (> 100 mg gefriergetrocknetes Gewebe) durch Eisaffinitätsreinigung (IAP) gereinigt und durch MALDI-MS, Aminosäurezusammensetzung und/oder Tandem-Massenspektrometrie charakterisiert. Von einigen Arten wurden Transkriptome generiert, um AFP-Sequenzen auf Nukleinsäureebene abzuleiten und in einigen Fällen die kodierten Proteine ​​rekombinant zu exprimieren. Die in den verschiedenen hier getesteten Collembola vorkommenden AFPs hemmten alle das Eiswachstum auf der Basalebene, was darauf hindeutet, dass sie hyperaktiv sein könnten. Wo eine detailliertere Analyse möglich war, wiesen alle untersuchten AFPs das gleiche glycinreiche Tripeptid-Wiederholungsmuster auf, das auf das PPII-Helixbündel hinweist. Bisher wurde diese Falte nur bei Collembolen gefunden und ihr Vorkommen bei entfernten Arten legt nahe, dass die PPII-Helixbündelfalte kurz nach der Entstehung der Gruppe von einer basalen Collembola-Art stammte.

Hier wurden 20 neue Arten aus fünf Familien auf TH getestet (Ergänzungstabelle 1). Die meisten Arten wurden von den Autoren vor Ort gesammelt, einige wenige stammten aus Kulturen anderer Laboratorien. Collembolen wurden typischerweise mehrere Jahre lang in Petrischalen mit feuchtem, mit Holzkohle vermischtem Gips gehalten und nach Belieben mit getrockneter Bäckerhefe und/oder Grünalgen gefüttert. Alle Arten wurden bei 20 °C mit 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit gehalten. Ausnahmen von diesem Verfahren bildeten M. arctica und Entomobrya nivalis, die vor Ort gesammelt und im Labor kalt akklimatisiert wurden (Ergänzungstabelle 1), und Cryptopygus antarcticus, die unmittelbar nach der Feldsammlung eingefroren wurden. H. harveyi29 und G. rainieri39, die die Untersuchungsgruppe von 22 Arten vervollständigten, wurden wie zuvor beschrieben gesammelt.

Um die AFP-Synthese zu induzieren, wurden die Proben 19 Tage lang in Dunkelheit und Kälte bei 10 °C akklimatisiert, gefolgt von 13 Tagen bei 5 °C und 28 Tagen bei 1,5 °C. Anschließend wurden die Tiere zwei Tage lang gefriergetrocknet. Getrocknete Tiere wurden im Verhältnis 1:8 (Gewicht/Volumen-Verhältnis) zu Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 150 mM NaCl, 1 mM Phenylthiocarbamid und 1 × EDTA-freier Roche-Protease-Inhibitor-Cocktail) gegeben und von Hand mit a homogenisiert Einweg-Kunststoffstößel in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Alle Manipulationen und die vorübergehende Lagerung der Proben erfolgten auf Eis oder bei 4 °C, um eine thermische Denaturierung des AFP zu verhindern. Die Homogenate wurden 30 Minuten lang bei 4 °C und 16.300 × g zentrifugiert. Für TH-Messungen wurde der wässrige Anteil unter der Lipidschicht entfernt.

AFP-Extraktionen zur Proteincharakterisierung wurden mit > 100 mg gefriergetrockneten Tieren durchgeführt. Gewebeproben wurden in Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 150 mM NaCl, 1 mM Phenylthiocarbamid und 1 × EDTA-freier Roche-Proteaseinhibitor-Cocktail) unter Verwendung eines IKA ULTRA-TURRAX-Dispergierers (Staufen, Deutschland) homogenisiert. Das Homogenat wurde 30 Minuten lang bei 22.000 × g zentrifugiert und der Überstand wurde durch Glaswolle filtriert, um Lipide zu entfernen. AFPs im gefilterten Überstand wurden mithilfe von vier Runden der Eisschalenreinigung wie zuvor beschrieben40 gewonnen. Die endgültige Eisfraktion für jede Zubereitung wurde unter Verwendung eines AmiconUltracel 3 K-Filters (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA), der in einer Sorvall ST16R-Zentrifuge bei 3000 × g zentrifugiert wurde, auf < 500 µL konzentriert.

Die Aminosäurezusammensetzungen wurden am SickKids Proteomics, Analytics, Robotics & Chemical Biology Centre (SPARC, The Hospital for Sick Children, Toronto, ON, Kanada) durch Säurehydrolyse wie zuvor beschrieben40 bestimmt und auch zur Berechnung der Proteinkonzentration verwendet.

MALDI-TOF MS wurde an der Protein Function Discovery Facility (Queen's University, Kingston, ON, Kanada) unter Verwendung einer Alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure-Matrix an getrockneten Tröpfchen mit einem SCIEX Voyager DE Pro im linearen Modus durchgeführt. Die Proteinsequenzierung mittels Tandem-Massenspektrometrie wurde am SickKids Proteomics, Analytics, Robotics & Chemical Biology Centre (SPARC, The Hospital for Sick Children, Toronto, ON, Kanada) durchgeführt.

RNA-Proben wurden aus 30 bis 50 mg Gewebe extrahiert, das in RNAlater (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) gelagert wurde. Die Extraktion wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt39. Das Transkriptom von C. antarcticus wurde am Sequencing & Genotyping Center (University of Delaware, Newark, DE, USA) zusammengestellt, und die von G. rainieri und E. nivalis wurden am Institute for Genome Sciences (University of Maryland, Baltimore) zusammengestellt , MD, USA).

Die AFP-haltigen Proben wurden auf einer Peltier-Einheit in ein mit Immersionsöl gefülltes Gitter injiziert. Die Temperatur wurde mit einem Nanoliter-Osmometer (Micro-Ice Ltd, Alon Shvut, Israel) und einem Temperaturregler Modell 3040 (Newport, Irvine, CA, USA) gesteuert. Die Proben wurden schockgefroren und langsam geschmolzen, bis ein einziger Eiskristall übrig blieb. Die Temperatur wurde knapp unter dem Schmelzpunkt gehalten und dann mit einer Geschwindigkeit von 0,075 °C/min gesenkt, bis das Eiswachstum einsetzte. Videos der Eiskristalle während der TH-Messungen wurden entweder mit der CCTV-Kamera WV-BL200 von Panasonic oder einer monochromen Industriekamera DMK 33UX249 USB 3.0 (The Imaging Source, Charlotte, NC, USA) aufgenommen.

Codon-optimierte, synthetische Gene für G. rainieri (QQY00623.1) und Folsomia candida (OXA44825.1) AFPs wurden bei GeneArt (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) bestellt. Die für das Signalpeptid kodierende DNA wurde entfernt und ein N-terminaler Methioninrest kodiert, um die Einführung einer NdeI-Schnittstelle zu unterstützen. Am C-Terminus wurden Leucin- und Glutamat-Codons eingeführt, um eine XhoI-Schnittstelle hinzuzufügen. Die Gene wurden in pET-24a-Vektoren subkloniert39. Die resultierenden Plasmide wurden zur Isolierung unter Verwendung eines GeneJET Plasmid Miniprep-Kits (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) in kompetente TOP10-Zellen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) transformiert. Die DNAs wurden sequenzgeprüft, bevor die Plasmide in BL21 (DE3)-Expressionszellen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) retransformiert wurden. Zellkulturen wurden in Lysogenie-Brühe-Medium mit 100 µg/ml Kanamycin bei 37 °C gezüchtet. Bei Erreichen einer OD600 von 0,6–0,8 wurden die Zellkulturen auf 20 °C abgekühlt und 1 mM Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranosid zugegeben, um die Zellkultur über Nacht zu induzieren. Die Zellen wurden 30 Minuten lang bei 4500 × g zentrifugiert und in 50 ml Lysepuffer (20 mM Tris/HCl (pH 7,8), 500 mM NaCl, 5 mM Imidazol, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und einer gelösten Tablette cOmplete™ ultra resuspendiert Protease-Inhibitor-Cocktail). Die Zellen wurden 16 Mal mit 10 Sekunden pro Runde beschallt und zwischen den Zyklen auf 4 °C abgekühlt, um eine Denaturierung des Proteins zu verhindern.

His-markierte rekombinante AFPs wurden mittels Ni-Affinitätschromatographie vom Lysatüberstand abgetrennt. AFP-haltige Fraktionen wurden gepoolt, in einen mit einer Eisschale beimpften 250-ml-Rundkolben geladen und durch Eisaffinität gereinigt39.

Die Taxonomie-IDs für jede Art wurden aus der NCBI-Taxonomiedatenbank extrahiert. Der phylogenetische Baum wurde mit phyloT (https://phylot.biobyte.de/) zusammengestellt.

Ganze Homogenatüberstände von 22 verschiedenen Collembola-Arten wurden auf TH-Aktivität und Eiskristallbildung untersucht (Abb. 1). Von den 22 getesteten Arten hatten 18 TH-Aktivität. Die in aktiven Homogenaten beobachteten einzelnen Eiskristalle schmolzen zu definierten länglichen Formen, die symmetrisch um die c-Achse waren, was darauf hindeutet, dass die AFPs an mehrere Eisebenen, einschließlich der Basalebene, binden und diese stabilisieren. Im Gegensatz dazu schmelzen Kristalle, die in Gegenwart eines AFP gebildet werden, das nicht an die Basalebene bindet, nämlich AFP vom Typ I, zu Scheiben, die beim Abkühlen zu hexagonalen Bipyramiden wachsen (Abb. 1, obere linke Tafel). Wenn der Gefrierpunkt in Collembolan-Proben überschritten wurde, ging von den a-Achsen ein dendritisches Eiswachstum aus, das in Proben mit hoher TH-Aktivität schnell wuchs. Bei Hypogastrura viatica und M. arctica deckte der Dendritenausbruch das Sichtfeld innerhalb eines Bildes (1/12 s) ab. Im Gegensatz dazu waren die Eiskristalle in der Pufferkontrolle scheibenförmig und wuchsen in derselben Form weiter, während der Ausbruch mit AFP vom Typ I entlang der c-Achse erfolgte (Abb. 1, obere rechte Tafel). Die Proben wurden mit den gleichen W/V-Verhältnissen homogenisiert, was Vergleiche der relativen TH-Aktivität ermöglichte, und die Aktivität in verschiedenen Spezies lag im Bereich von 0,2 bis 1,7 °C. Diese Unterschiede könnten auf Variationen in der Genkopienzahl, den Expressionsniveaus und/oder der Aktivität der AFPs zurückzuführen sein.

Vergleich der Eisformung in Collembolan-Homogenaten. Gefriergetrocknete Collembola wurden vorsichtig in Puffer (8:1 v/w) homogenisiert und die Überstände wurden auf Frostschutzaktivität (TH) untersucht. Für jede Art (linke Spalte) wurde ein Bild aus dem Video während der TH-Messung (mittlere Spalte) und genau dann, als der Gefrierpunkt überschritten wurde (rechte Spalte), aufgenommen. Die Positivkontrolle ist AFP vom Typ I aus der Winterflunder (Pseudopleuronectes americanus). Die Negativkontrolle ist Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 150 mM NaCl, 1 mM Phenylthiocarbamid und 1 × EDTA-freier Roche-Protease-Inhibitor-Cocktail).

Die Fluoreszenz-Eisebenenanalyse der großen AFP-Isoform von H. harveyi zeigte eine Bindung sowohl an die Basal- als auch an die Prismenebene des Eises38. Die Bindung an die Basalebene wurde auch durch die Röntgenkristallstruktur von GrAFP gestützt, da das kristallographische Wasser sowohl an der Basalebene als auch an der primären Prismaebene von Eis ausgerichtet werden konnte 39 . Darüber hinaus lässt die hohe Aktivität (> 2 °C) von zwei der Homogenate darauf schließen, dass die meisten Collembola, wie auch bei anderen Arthropoden wie Tenebrio molitor41, hyperaktive AFPs produzieren. Darüber hinaus sind die konsistenten Unterschiede in der Eisform und dem Ausbruch zwischen Collembolan-AFPs und Typ-I-AFP aus der Winterflunder (Abb. 1) wahrscheinlich auf die Bindung der Collembolan-AFPs in der Basalebene zurückzuführen.

Über die Aminosäurezusammensetzung von AFPs, die aus drei Collembola-Arten (H. harveyi, G. rainieri und M. arctica) extrahiert wurden, wurde bereits berichtet29,31,39. Hier wurden auch AFP-Extrakte von drei weiteren Arten (Cryptopygus antarcticus, Folsomia candida und Protaphorura pseudovanderdrifti) einer Aminosäureanalyse unterzogen (Ergänzungstabelle 2). Alle wiesen hohe Mengen an Glycin und Alanin auf, die auf die Faltung des PPII-Helixbündels hinweisen. Allerdings waren diese Glycin- und Alaninanteile geringer als bei H. harveyi, das weiter gereinigt wurde, was auf eine gewisse Kontamination durch Spuren anderer Proteine ​​schließen lässt. Dies ist zu erwarten, da jede IAP-Runde die Nicht-AFP-Proteinspiegel nur um das Zehnfache reduziert40. Dennoch deutete MALDI-MS darauf hin, dass die AFPs nach IAP die dominierende Spezies waren (Abb. 2). Die Extrakte von P. pseudovanderdrifti (Abb. 2A), C. antarcticus (Abb. 2B) und Ceratophysella denticulata (Abb. 2C) zeigten alle einige diskrete Peaks, die zwei oder mehr kleinen Isoformen (5,9–8,8 kDa) und einem oder mehr entsprachen größere Isoformen (15,5–17,5 kDa), ähnlich wie zuvor für M. arctica (Abb. 2D)31 und H. harveyi (6,5 und 15,7 kDa)29 berichtet. Im Gegensatz dazu hat F. candida einen Hauptpeak, der aus vier Unterpeaks besteht, die sich um ~ 16 Da unterscheiden (Abb. 2E), und G. rainieri (Abb. 2F)39 weist drei Cluster von Isoformen innerhalb eines engeren Bereichs von 6,9–12,2 auf kDa. Es scheint auch kleine Abweichungen bei den Isoformen zu geben, wie die Schulterspitzen zeigen. Ähnlich wie die fünf 9,6-kDa-Isoformen von G. rainieri39 gibt es in jeder Population wahrscheinlich Isoformen mit einigen Aminosäurepolymorphismen.

MALDI-Spektren von gereinigten Collembolan-AFP-Extrakten. Proteine ​​aus: (A) Protaphorura pseudovanderdrifti, (B) Cryptopygus antarcticus, (C) Ceratophysella denticulata, (D) Megaphorura arctica, (E) Folsomia candida und (F) Granisotoma rainieri wurden mit vier Runden Eisaffinitätsreinigung gereinigt MALDI-MS unterzogen. Die wichtigsten Spitzenmassen sind gekennzeichnet.

Die teilweise Sequenzierung der gereinigten AFPs durch Tandem-Massenspektrometrie tryptischer Fragmente liefert eine robuste Verbindung zwischen den isolierten Proteinen und ihren Nukleinsäuresequenzen. Dies hat zuvor dazu beigetragen, AFP-Sequenzen von M. arctica und G. rainieri in voller Länge aus Transkriptomdaten abzuleiten31,39. In dieser Studie waren tryptische Fragmente von C. antarcticus- und F. candida-AFPs auch reich an Glycin und Alanin und enthielten GXX-Wiederholungsmotive (Tabelle 1).

Die NCBI-Datenbank enthält über 3400 C. antarcticus-ESTs aus zwei Studien42,43. BLAST-Suchen identifizierten zwei mit Kodierungssequenzen voller Länge (GR869204.1 und FF279148.1) und zwei mit unvollständigen Kodierungssequenzen (GR870234.1 und FF278983.1). Die Transkripte voller Länge kodierten nach der Entfernung des 19 Aminosäuren langen Signalpeptids für ein 108 Aminosäuren langes Protein (8,5 kDa) (Abb. 3A). GR870234.1 fehlte das N-terminale Methionin-Startcodon und FF278983.1 hatte einen verkürzten C-Terminus am Rest 86. Peaks mit ähnlichen Massen wurden im MALDI-Profil gesehen (Abb. 2B). Zusätzliche Isoformen wurden innerhalb des in dieser Studie generierten Transkriptoms identifiziert; drei, die 8,5-kDa-Isoformen kodieren (OQ445583, OQ445586 und OQ445587) und acht, die 15-kDa-Isoformen kodieren (OQ445584, OQ445585, OQ445588, OQ445589, OQ445590, OQ445591, OQ4455). 92, OQ445593). Die 8,5-kDa-Isoformen hatten eine Sequenzidentität zwischen 91 und 93 % auf Nukleotid- und Proteinebene (Abb. 3A). Mithilfe eines Schemas zur Visualisierung jeder Helix können die 8,5-kDa-Isoformen so modelliert werden, dass sie 6 Helices haben (Abb. 3B). Die Ketten aus 3–4 GX1X2-Wiederholungsmotiven können in einzelne Helices unterteilt werden, die durch variable Schleifenregionen mit einer Länge von 3–6 Aminosäureresten getrennt sind. Die X2-Reste in einer Helix und der folgenden Helix wechseln zwischen einem hydrophoben und einem hydrophilen Rest, und dies erzeugt die charakteristische Eisbindungsstelle (blaue Flächen in Abb. 3) und die nicht eisbindende Stelle (rote Flächen in Abb. 3). Die 15-kDa-Isoformen gruppierten sich in drei Gruppen. Die erste Gruppe hatte drei Isoformen mit einem 20 Aminosäuren langen Signalpeptid und einem 192 Aminosäuren langen reifen Protein (Abb. 4A). CaAFPb-4 wies eine Deletion von vier Aminosäuren auf, wodurch das reife Protein eine Länge von 188 Aminosäuren hatte. Die zweite Gruppe hatte drei Isoformen mit einem 19 Aminosäuren langen Signalpeptid und einem 192 Aminosäuren langen reifen Protein (Abb. 4B). Der dritte Typ hatte eine einzelne Isoform (CaAFPb-8) mit einem 19 Aminosäuren langen Signalpeptid und einem 187 Aminosäuren langen reifen Protein (Abb. 4C). Innerhalb der ersten und zweiten Gruppe zeigten die Isoformen eine Sequenzidentität zwischen 88–99 % bzw. 98–99 %, während zwischen diesen Gruppen und dem dritten Isoformentyp nur eine Sequenzidentität von 50–52 % bestand. Innerhalb jeder Gruppe waren die Aminosäuresequenzen in den Schleifen- und Nicht-IBS-Regionen zwischen den Isoformen weniger konserviert. Beim Vergleich der drei Gruppen der 15-kDa-CaAFPs war die Anzahl der PPII-Helices konstant, wobei 11 vorhergesagt wurden (Abb. 4), und die Länge jeder Helix war ungefähr gleich, mit jeweils drei bis vier GXX- oder GGX-Wiederholungen. Darüber hinaus variierte die Anzahl der vorhergesagten Disulfidbindungen zwischen 2 und 4. Die vorhergesagten Durchschnittsmassen von CaAFPb-8 (15,2 kDa) und CaAFPb-6 (15,5 kDa) stimmen weitgehend mit den von MALDI beobachteten Peaks 15.158 und 15.463 Da überein (Abb. 2B).

Sequenzabgleich der 8,5-kDa-CaAFP-Isoformen. (A) Die Aminosäuresequenzen von CaAFP-Isoformen aus ESTs und dem generierten Transkriptom wurden abgeglichen. Identische Aminosäurereste werden grau hervorgehoben. Glycinreste sind blau gefärbt. Cysteinreste sind rot gefärbt und gelb hervorgehoben. Die Signalpeptide werden in Kleinbuchstaben und die kodierende Sequenz in Großbuchstaben angezeigt. Die Rechtecke unten zeigen mutmaßliche PPII-Helices für die IBS- (blau) und Nicht-IBS-Flächen (rot). CaAFPa-1, OQ445586; CaAFPa-2, GR870234; CaAFPa-3, OQ445587; CaAFPa-4, FF279148; CaAFPa-5, OQ445583; CaAFPa-6, GR869204; CaAFPa-7, FF278983. (B) Schematische Darstellung von sechs Polyprolin-Typ-II-Helixbündeln. Die antiparallelen Helices sind durch Schleifenregionen (nicht dargestellt) verbunden und in zwei Schichten angeordnet. Dargestellt sind die eisbindende Oberfläche (blau) und die nicht eisbindende Oberfläche (rot). Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Helices stabilisieren die Falte.

Sequenzabgleich der 15-kDa-CaAFP-Isoformen. Die Aminosäuresequenzen der CaAFP-Isoformen aus dem generierten Transkriptom wurden für die (A) erste und (B) zweite Gruppe abgeglichen. (C) Die dritte CaAFP-Isoform (CaAFPb-8) ist an eine Sequenz aus der ersten Gruppe (CaAFPb-3) und der zweiten Gruppe (CaAFPb-6) ausgerichtet. Die Färbung ist die gleiche wie in Abb. 3. CaAFPb-1, OQ445590; CaAFPb-2, OQ445584; CaAFPb-3, OQ445585; CaAFPb-4, OQ445589; CaAFPb-5, OQ445588; CaAFPb-6, OQ445592; CaAFPb-7, OQ445593; CaAFPb-8, OQ445591.

Es wurde festgestellt, dass der annotierte Aufbau des Genoms von F. candida44 ein einzelnes Gen enthält, das für eine glycinreiche Sequenz (OXA44825.1) kodiert, hier FcAFP genannt, die anderen helikalen PPII-AFPs ähnelt. FcAFP weist eine Sequenzidentität von 57 % mit GrAFP-4 auf (Abb. 5A). Es wurde vorhergesagt, dass FcAFP eine Struktur hat, die der durch Kristallographie gelösten GrAFP-4 sehr ähnlich ist39, wobei neun PPII-Helices eine Eisbindungsfläche bilden, die aus den vier geraden Helices besteht.

Schematische Darstellung des spiralförmigen Polyprolin-Typ-II-Bündels. Die Proteinsequenzen von FcAFP und CcAFP sind in einzelnen Polyprolin-Helices angeordnet. (A) FcAFP kann in 9 Helices angeordnet werden und (B) CcAFP kann in 12 Helices angeordnet werden. Die Färbung ist die gleiche wie in Abb. 3.

Die mittels Tandem-Massenspektrometrie analysierten tryptischen Fragmente (Tabelle 1) stützen die Behauptung, dass F. candida im Gegensatz zu den anderen untersuchten Arten nur eine AFP-Isoform aufweist. Die dominanten Spektren stimmten mit den drei vorhergesagten tryptischen Fragmenten überein und wurden über den größten Teil ihrer Länge mehrfach sequenziert. Da das Genom44 und diese Probe (Ergänzungstabelle 1) von demselben parthenogenetischen Laborstamm stammten, war diese genaue Übereinstimmung nicht unerwartet. Ähnliche Fragmente unterschiedlicher Masse entstanden entweder durch In-Source-Fragmentierung des tryptischen Fragments45 oder durch posttranslationale Modifikation. Fragmente waren manchmal 16 Da schwerer als erwartet, wobei die zusätzliche Masse mit Prolinresten zusammenfiel, denen Glycinreste folgten (Tabelle 1, fett gedruckt).

Die Gensequenz und die tryptischen Fragmentsequenzen stimmten mit den durch MALDI-MS beobachteten Massen überein. Der dominante Peak lag bei 9646 m/z, die doppelt geladene Spezies bei 4832 m/z, aber eine genaue Untersuchung des Spektrums (Abb. 2E, Einschub) zeigt vier Peaks, die sich um etwa 16 Da unterscheiden. Die leichteste mit 9632 m/z entspricht weitgehend der durchschnittlichen Masse von 9630 Da, die für das reife Protein ohne Modifikationen vorhergesagt wurde, während die anderen bei 9464, 9663 und 9679 wahrscheinlich jeweils 1, 2 oder 3 modifiziertes Prolin enthalten. Eine Massenzunahme von 16 Da steht im Einklang mit der Hydroxylierung von Prolin. Kollagen enthält X1-X2-G-Wiederholungen und die Struktur besteht aus drei parallelen PPII-Helices, die die Kollagen-Dreifachhelix46 bilden. Prolin wird innerhalb der XPG-Motive durchgehend zu Hydroxyprolin modifiziert47. Daher ist es wahrscheinlich, dass derselbe Prozess im Durchschnitt für die Modifikation eines der sechs XPG-Motive im AFP verantwortlich ist, da die Sequenzwiederholungen und die Sekundärstruktur der beiden Proteine ​​ähnlich sind.

Das aus F. candida extrahierte Protein wies bei der getesteten Konzentration nur eine TH-Aktivität von 0,2 °C auf, weniger als bei den meisten anderen Arten (Abb. 1). Bei rekombinanter Expression in E. coli erreichte FcAFP 0,52 ± 0,01 °C TH bei einer Konzentration von nur 2,3 μM. Dies deutet darauf hin, dass selbst nach Kälteakklimatisierung die von diesem einzelnen Gen im Tier produzierten AFP-Werte weit unter dem liegen, was in vitro erreicht werden kann. Trotz der Bildung eines AFP überlebte keines der Exemplare, als F. candida 15 Tage lang –3 °C ausgesetzt wurde32. Im ausgehungerten Zustand liegt ihr Unterkühlungspunkt jedoch unter −15 °C48. Arthropoden mit hoher TH-Aktivität haben im Allgemeinen mehr als ein AFP-Gen und produzieren unterschiedliche AFP-Isoformen, wie am Beispiel des Fichtenknospenwurms mit seinen 16 Genkopien49 und den anderen Springschwänzen hier gezeigt.

Es war zuvor bekannt, dass Entomobrya nivalis in den Wintermonaten eine TH-Aktivität von bis zu 3,5 °C in ihrer Hämolymphe aufweist50. Daher wurde die begrenzte Anzahl der auf dem Feld gesammelten Tiere akklimatisiert, bevor ihre RNA extrahiert wurde. Es wurde ein Transkriptom erstellt, aus dem fünf AFP-Isoformen identifiziert wurden (ergänzende Abbildung 1B). Jede Sequenz hatte ein Signalpeptid mit einer Länge zwischen 22 und 24 Aminosäuren. Die reifen Proteine ​​hatten vorhergesagte Massen von 8,9 kDa, 9,6 kDa und 11,2 kDa. Die 8,9-kDa-Isoform (EnAFP-2) war zu 86 % identisch mit der 11,2-kDa-Isoform (EnAFP-3) mit einer Deletion von 29 Aminosäuren, die wahrscheinlich zwei Helices entfernt. Die anderen Sequenzen hatten zwischen 64 und 81 % Identität.

Unter Verwendung der Sequenzen anderer Collembolan-AFPs als BLAST-Abfrage wurde im Genom von Ceratophysella communis (VNWX01004235.1) eine Sequenz gefunden, die einem PPII-helicalen AFP ähnelt. Es wurde vorhergesagt, dass das Gen ein einzelnes Intron51 und den daraus resultierenden offenen Wert von 732 bp enthält Der Rahmen kodierte ein AFP, von dem vorhergesagt wurde, dass es ein Signalpeptid mit 23 Aminosäuren aufweist52. Das reife Protein hatte eine Länge von 220 Aminosäuren und kann mit 12 PPII-Helices modelliert werden (Abb. 5B). Obwohl C. communis nicht gesammelt wurde, war es C. denticulata, und das Homogenat hatte 0,7 °C TH (Abb. 1). Darüber hinaus hatte der größte Peak im MALDI-MS eine Masse von 17,5 kDa, ähnlich den 17,2 kDa, die für die reife AFP-Sequenz von C. communis vorhergesagt wurden.

Zehn der beprobten Collembolan-Arten stammten von Poduromorpha und zwölf von Entomobryomorpha (Abb. 6). Alle zehn Poduromorphen und acht Entomobryomorphen hatten AFP-Aktivität. Die vier Arten ohne AFP-Aktivität stammten aus der Familie der Entomobryidae, aber auch E. nivalis gehörte zu dieser Familie und besaß AFP-Aktivität. Vierzehn andere Arten wurden von anderen auf TH-Aktivität getestet28,30,53, wobei insgesamt 11 von 11 Poduromorphen und 15 von 25 Entomobryomorphen positiv auf AFP-Aktivität getestet wurden. Von den Arten, die keine AFPs produzierten, wurden wiederum zwei bei Entomobryidae und vier bei Isotomidae gefunden.

Taxonomischer Baum der Frostschutzprotein produzierenden Collembola. Basierend auf der NCBI-Taxonomie wurde ein taxonomischer Baum für Arten aus den vier Ordnungen der Collembola (Entomobryomorpha, Poduromorpha, Symphypleona und Neelipleona) erstellt. Arten mit und ohne TH-Aktivität sind in Rot bzw. Blau eingefärbt, nicht getestete Gruppen in Schwarz. Die in diesem Artikel untersuchten Arten sind fett gedruckt und alle anderen nicht fett gedruckten Arten wurden von Zettel28 getestet, mit Ausnahme von Gomphiocephalus hodgsoni30 und Cryptopygus terranovus (syn. Gressittacantha terranova)53. Arten mit einem Stern produzierten glycinreiche AFPs. Gomphiocephalus hodgsoni mit einem roten Quadrat ist ein vorgeschlagenes Cystin- und Histidin-reiches AFP30.

Es wurde vorhergesagt, dass das glycinreiche PPII-Helixbündel die AFP-Faltung von acht Collembola-Arten ist, die fünf Familien und zwei Ordnungen umfassen. Das Vorhandensein helikaler PPII-AFPs sowohl in Entomobryomorpha als auch in Poduromorpha legt nahe, dass diese Proteinfamilie vor ihrer Divergenz entstand (Abb. 7). Die genaue Abfolge der taxonomischen Diversifizierung der Collembolen wird immer noch diskutiert. Die vier Ordnungen können abhängig von den verwendeten Datensätzen in verschiedene Schwestergruppen eingeteilt werden. Bei Verwendung der 18S- und 28S-Sequenzen war Neelipleona basal zu (Symphypleona + (Entomobryomorpha + Poduromorpha)54. Bei Verwendung der 16S-, 28S- und cox1-Sequenzen waren die Positionen von Neelipleona und Symphypleona jedoch vertauscht und Symphypleona war basal55. Unabhängig von der genauen phylogenetischen Verwandtschaft Mitochondriale Datierungen deuten darauf hin, dass die vier Ordnungen vor 437 bis 421 Millionen Jahren auseinander gingen. Dieser Zeitraum fällt mit der Anden-Sahara-Eiszeit zusammen, einer Eiszeit, die vor 460 bis 420 Millionen Jahren dauerte. 57 Darüber hinaus divergierten die Abstammungslinien der bestehenden Familien Vor 414 bis 184 Millionen Jahren56, in der die Karoo-Eiszeit stattfand, also vor 360 bis 255 Millionen Jahren58. Diversifizierung und die Notwendigkeit einer Frostbeständigkeit im gleichen Zeitraum würden die Strahlung der Arten ermöglichen, die PPII-helicales AFP exprimieren.

Die Beziehung zwischen Collembolan-Phylogenie und Eiszeiten. Ein phylogenetischer Baum, der die Zeitlinie der Divergenz in Collembola zeigt. Die schattierten Farben Grün, Lila und Gelb zeigen die geschätzten Zeiten für die Divergenz von Ordnungen, Familien bzw. Gattungen/Arten. Die Anzahl der AFP-produzierenden Arten wird unter dem Ordnungsnamen angezeigt. Der rote Pfeil zeigt die Entstehung von Fisch-AFPs im Känozoikum. Eisberge zeigen die Zeitspanne der jeweiligen Eiszeit an.

Der Zeitpunkt der Diversifizierung in Gattungen könnte dazu geführt haben, dass es Arten an AFPs mangelt. Innerhalb der Überfamilie Entomobryoidea zeigten Sinella curviseta, Heteromurus nitidus, Lepidocyrtus violaceus und drei Arten aus der Gattung Orchesella keine AFPs mit Frostschutzwirkung, E. nivalis hingegen schon (Abb. 6). Analysen einer Probe von Collembola aus China ergaben, dass sich fünf polyphyletische Gruppen der Gattung Entomobrya vor 66 bis 34 Millionen Jahren während des thermischen Maximums zwischen Paläozän und Eozän diversifizierten59. In diesem Zeitraum, vor etwa 55 Millionen Jahren, waren die globalen Temperaturen im Durchschnitt 5–8 °C höher als heute60. Es wird geschätzt, dass Sinella vor etwa 69 Millionen Jahren von einer Entomobrya-Gruppe abgespalten ist, während Heteromurus und Orchesella vor etwa 100 Millionen Jahren von der Familie Entomobryidae abgespalten sind59. Der Vorfahr der AFP-defizitären Arten in der Überfamilie Entomobryoidea könnte in diesem Zeitraum ihr AFP verloren haben, was zur Strahlung von Arten ohne AFP-Gen führte, während die E. nivalis-Linie ihr AFP behielt.

Im Gegensatz zu Knochenfischen, bei denen AFPs erst im Känozoikum (vor etwa 30 Millionen Jahren) nach dem Paläozän-Eozän-Wärmemaximum entstanden20, gibt es keine Anzeichen für eine plötzliche Diversifizierung der Collembolan-AFPs während dieses Ereignisses oder der vorherigen Karoo-Eiszeit. Theoretisch könnten bestimmte Abstammungslinien während einer Zwischeneiszeit ihre Gene vom PPII-AFP-Typ verloren haben, nur um einen Ersatz zu entwickeln, um mit einer neuen Eiszeit fertig zu werden. Aus diesem Grund ist die unterschiedliche Aminosäurezusammensetzung eines AFP erwähnenswert, das zuvor in der antarktischen Collembolan-Art Gomphiocephalus hodgsoni30 identifiziert wurde. Dieses AFP enthielt hohe Prozentsätze an Histidin und Cystin, wodurch es sich von den AFPs vom PPII-Typ unterschied (Ergänzungstabelle 2). Die Sequenz dieses AFP ist jedoch noch nicht identifiziert. Interessanterweise gehört diese Art zur Familie der Hypogastruridae, in der zwei Arten (H. harveyi und C. communis) glycinreiche PPII-helicale AFPs produzieren.

Der Ursprung und die Verwandtschaft der PPII-AFPs sind schwer zu bestimmen, da die repetitive Natur des Proteins Vergleiche zwischen entfernt verwandten Arten äußerst schwierig macht. Aus sich wiederholenden Sequenzen kann nicht einfach auf Homologie geschlossen werden, insbesondere wenn sie auf ihre Frostschutzaktivität hin ausgewählt werden. Beispielsweise schienen die Alanin-reichen Typ-I-AFPs von Fischen, von denen einige Threoninreste in Abständen von 11 Aminosäuren aufweisen, zunächst homolog zu sein, doch mittlerweile ist bekannt, dass sie sich innerhalb der letzten 30 Millionen Jahre durch Konvergenz entwickelt haben15. Glücklicherweise konnte der Ursprung der Flunder-Typ-I-AFPs über ihre UTRs20 zurückverfolgt werden. Möglicherweise spielte die Konvergenz auch eine Rolle bei der Entwicklung der Collembolan-AFPs. Dies scheint jedoch unwahrscheinlich, da alle bis auf eine untersuchte Art glycinreiche AFPs produzieren und die bekannten Sequenzen PPII-Helixbündel mit einer eis- Bindungsfläche. Im Gegensatz dazu wurden bei der Entstehung von AFPs in Knochenfischen und Insekten eine Vielzahl unterschiedlicher Proteinfalten als AFPs verwendet61,62,63,64,65. Darüber hinaus variiert die Länge der PPII-Helices nicht zwischen Isoformen oder Spezies. Wenn jeder Helix von GrAFP eine zusätzliche GGX-Wiederholung hinzugefügt wurde, nahm die TH-Aktivität ab, was darauf hindeutet, dass dies ein selektiver Druck zur Begrenzung der Länge der Helices sein könnte37.

Es ist unwahrscheinlich, dass eine Analyse der UTRs von Collembolan-AFPs Hinweise auf deren Herkunft liefern wird. Viele der hier untersuchten Arten divergierten viel früher als Knochenfische (Abb. 7). Dadurch hatten ihre nichtkodierenden Regionen genügend Zeit, sich so stark zu divergieren, dass sie nicht mehr als homolog erkennbar waren. Dies ist selbst dann offensichtlich, wenn die 5ʹ- und 3ʹ-UTRs zwischen Transkripten einer einzelnen Art verglichen werden. Beispielsweise weisen die 5ʹ- und 3ʹ-UTRs von EnAFPs eine Sequenzidentität zwischen 65–93 % bzw. 60–84 % auf. Das Fehlen einer nichtkodierenden Sequenzidentität wurde bereits zuvor zwischen HhAFP und MaAFP31 sowie zwischen Isoformen von HhAFP38 und GrAFP39 berichtet. Dies deutet darauf hin, dass einige dieser PPII-AFPs, sogar solche derselben Art, schon weitaus länger als 30 Millionen Jahre divergieren.

Eine Einschränkung dieser Studie war unsere Unfähigkeit, Arten von Neelipleona oder Symphypleona zu beproben. Derzeit sind die genomischen und transkriptomischen Daten für diese Ordnungen im Vergleich zu Entomobryomorpha und Poduromorpha unterrepräsentiert, aber neun Genomsequenzen sind am NCBI öffentlich verfügbar. Obwohl in den acht Symphypleona- und einer Neelipleona-Genomsequenzen keine PPII-AFPs gefunden wurden, sollte beachtet werden, dass die repetitive Natur der PPII-AFPs zusammen mit der Fülle an glycinreichen Genen (wie Kollagen), Introns und repetitiven Sequenzen reichlich vorhanden ist mit potenziellen Glycin-Codons erschweren die Identifizierung von AFP-Genen. Daher ist die Identifizierung dieser AFPs stark von der Gewebeextraktion abhängig. Leider ist die Laborkultivierung von Symphypleona und Neelipleona unseres Wissens nach schwierig, was detaillierte Studien zu AFPs in diesen beiden Ordnungen erschwert.

Die während der aktuellen Studie generierten Datensätze sind im GenBank-Repository (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) unter den Zugangsnummern OQ511494-98 und OQ445583-93 verfügbar.

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Wir danken David McLeod von der Protein Function Discovery Facility an der Queen's University für die MALDI-Analyse von AFPs. Wir danken Marie Boddington für die vorläufige Analyse der AFPs von Megaphorura arctica und Folsomia candida, David Denlinger für die Sammlung von Cryptopygus antarcticus und Matty Berg für die Sammlung von Isotoma riparia. Diese Arbeit wurde durch den CIHR Foundation Grant FRN 148422 an PLD und den Det Frie Forskningsråd Grant 1026-00055B an MH unterstützt. PLD ist Inhaber des Canada Research Chair in Protein Engineering. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, der Datenerhebung/-analyse/-interpretation, dem Verfassen von Berichten oder der Einreichung des Artikels zur Veröffentlichung.

Abteilung für Biomedizinische und Molekulare Wissenschaften, Queen's University, 18 Stuart Street, Kingston, ON, K7L3N6, Kanada

Connor L. Scholl, Laurie A. Graham und Peter L. Davies

Abteilung für terrestrische Ökologie, Abteilung für Ökowissenschaften, Universität Aarhus, CF Møllers Allé 4, 8000, Aarhus C, Dänemark

Martin Holmstrup

Arktisches Forschungszentrum, Universität Aarhus, Ny Munkegade 114, 8000, Aarhus C, Dänemark

Martin Holmstrup

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Konzeptualisierung, PLD, MH und LAG; Methodik, alle Autoren; Untersuchung, CLS und LAG; Ressourcen, PLD und MH; Schreiben – Original, CLS, PLD und LAG; Schreiben – Rezension und Bearbeitung, alle Autoren; Visualisierung, CLS; Finanzierungsakquise, PLD und MH

Korrespondenz mit Peter L. Davies.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Scholl, CL, Holmstrup, M., Graham, LA et al. Helixförmige Polyprolin-Frostschutzproteine ​​vom Typ II sind in Collembola weit verbreitet und entstanden wahrscheinlich vor über 400 Millionen Jahren im Ordovizium. Sci Rep 13, 8880 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35983-y

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Eingegangen: 31. März 2023

Angenommen: 26. Mai 2023

Veröffentlicht: 01. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35983-y

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